β-环糊精β-cyclodextrin,β-CD)水溶性低、毒性大，因而限制了其在药学领域的广泛应用[1]。为了改进β-CD的性能，我们合成了聚氧化乙烯基-β-环糊精  (Polyoxyethylene-β-cyclodextrin，PE-β-CD)，并对其溶血作用进行了测定，比较了β-CD、羟丙基-β-环糊精(Hydroxpropyl-β-cyclodextrin,HP-β-CD)和PE-β-CD的溶血作用，并测定了PE-β-CD对水不溶性药物槲皮素的增溶作用。
1  材料与方法
1．1  药品及仪器  环氧乙烷系常州市东风化学品研究所产：β-CD系上海化学试剂站中心化工厂产；HP-β-CD系西安德立生物化工有限公司产，含量98％；槲皮素由本校药物化学教研室提供，含量98％；其它试剂均为分析纯。
Agilen8453型紫外分光光度计、NEXUS470型傅立叶变换红外光谱仪均系美国惠普公司产；A-VANCE600核磁共振波谱仪为瑞士Bruker公司产；磁力搅拌器系上海雷磁仪器厂产；80-2型离心机系江苏金坛市中大仪器厂产；超级恒温器系重庆试验设备厂产。
1．2  PE-β-CD的制备  在室温下，将12g(0．3mol／L)NaOH和250ml H2O加入到500ml的三角瓶中，NaOH溶解后再加入118．82g(0．1mol／L)干燥恒重的β-环糊精，搅拌使其溶解，控温在40~60℃，在搅拌中缓慢通入环氧乙烷100ml，至环氧乙烷完全反应。用适量HCl将反应液中和至中性，
脱盐、浓缩、冷冻干燥，得白色粉末状PE-β-CD110．06g。
1．2．1  PE-β-CD的鉴定
1．2．1．1  红外吸收光谱法用KBr将β-CD和PE-β-CD分别压片，在400~4000cm-1范围内测红外吸收光谱。
1．2．1．2  核磁共振波谱法  用D2O为溶剂，在298．15K、600MHz测定β-CD和PE-β-CD的13C-NMR波谱。
1．3  PE-β-CD平均取代度的测定按照文献[2]的方法测定。
1．4  紫外吸收光谱  将β-CD、HP-β-CD和PE-β-CD分别配成稀溶液，在200~600nm的波长范围内扫描。
1．5  溶血作用的测定[4,5]
1．5．1  红细胞的制备  取兔全血5ml，注入内加玻璃珠的锥形瓶中，摇动10min，倾出血液，3000r／min离心10min，除去血浆，分离出红细胞，用PBS洗涤3次，以除去从破坏的血红细胞中释放出的正铁血红素。红细胞用PBS稀释至按离心沉降法所测定的红细胞压积约12，于6℃保存不超过12h。
1．5．2  溶液的配制  准确称量β-CD1．4190g，HP-β-CD 15．4 700g，PE-β-CD 20．5 900g，分别放入100ml的容量瓶中，用PBS溶解并定容至100ml，再分别稀释成一系列不同浓度测定溶血作用。
1．5．3  溶血作用的测定  于37cC恒温的2ml环糊精溶液中加入红细胞悬浮液100μl，立即倒转摇匀样品。于37℃保温5min，3000r/min离心10min，在543nm处用分光光度法分析上清液释放的正铁血红素。溶血度以百分比报告，在上述步骤中用2ml蒸馏水代替环糊精溶液，以其释放出的正铁血红素为百分之百。
1．6  PE-β-CD对槲皮素的增溶作用
1．6．1  标准曲线的测定  用30％的乙醇水溶液将槲皮素配成浓度为0、1．00、2．00、3．00、4．00、5．00、6．00、7．00μg·ml-1的系列标准溶液，在375nm处测吸收值，得回归方程：c(μg／ml)=14．3 106A+0．3 888  r=0．99971．6．2  增溶作用  在含聚氧化乙烯基-β-CD为5．00、10．00、15．00、20．00、25．00、30．00、35．00  mmol／L的10ml水溶液中，加入过量的槲皮素(0．2~0．3g)，摇动，于65℃恒温24h，间隔一定时间摇动，再于25℃恒温12h，分别取上清液1．00、1．00、0．500、0．500、0．300、0．300、0．200ml置于50ml容量瓶中，用300%的乙醇溶液定容至刻度，在375nm处测吸收值。用标准曲线的回归方程计算出槲皮素的浓度，再换算为摩尔浓度。
2  结  果
2．1  红外吸收光谱  β-CD的主要红外吸收峰为3416.08cm-1、2927．15cm-1、1632．77cm-1、1412．72cm-1、1384.10cm-1、1366．95cm-1、1301．01cm-1、1239．91cm-1、1 201．92 cm-1、1 155．67 cm-1、1 079．60 cm-1、1029．52cm-1、857．79cm-1、578．35cm-1。PE-β-CD新增加的红外吸收峰为2 968．88cm-1、1 458．76cm-1、1 409．41cm-1、1 158．45 cm-1、949．08 cm-1、870．68 cm-1、756．81cm-1、705．95cm-1，消失的吸收峰有的1 412．72cm-1、
1 384．10 cm-1、1 155．67 cm-1、1 079．60 cm-1、857．79cm-1。

1. β-CD和PE-β-CD的13C-NMR波谱β-CD和PE-β-CD的13C-NMR化学位移 见表1。

表1 β-CD和PE-β-CD的13C-NMR化学位移(10-6)

              7    8    9    10
注：-O-CH2CH2OCH2CH2OH；*β-CD的数据
与β-CD的13C-NMR化学位移对比，PE-β-CD的C6和C2的13C-NMR化学位移移向低场[7]，再根据取代度的数据，可以判定C6和C2上的羟基加合上了聚氧化乙烯基，而C3的化学位移变化不规则，当化学位移移向低场时，C3的羟基上加合上了聚氧化乙烯基；当化学位移移向高场时，C3的羟基上没加合上聚氧化乙烯基，而是C2的羟基上加合上聚氧化乙烯基后对它的影响。PE-β-CD的平均取代度为20．1。因此，该产物是一种混合物。
2．3  β-CD、HP-β-CD和PE-β-CD的紫外吸收光谱  β-CD、HP-β-CD和PE-β-CD的紫外吸收光谱表明，所有吸收曲线在320nm以上均无吸收。在槲皮素的最大吸收波长375nm处测吸收值，不会受增溶剂的影响。
2．4  β-CD、HP-β-CD和PE-β-CD的溶血作用见图1。由图1可见，溶血作用依次为β-CD>HP-β-CD>PE-β-CD，溶血作用随溶液浓度的增大而增加。

图1  β-CD、HP-β-CD和PE-β-CD溶血作用
Fig．1 Hemolysis of β-CD，HP-β-CD and PE-β-CD
2．5  PE-β-CD对槲皮素的溶解度的影响  在25℃下，β-CD和PE-β-CD对槲皮素的溶解度的影响见图2，图3。

图2  β-CD对槲皮素的溶解度的影响
Fig．2  Effect ofβ-CD on solubility of quercetin

图3  PE-β-CD对槲皮素溶解度的影响
Fig．3  Effect of PE-β-CD on solubility of quercetin
3  讨  论
由红外吸收光谱图、核磁共振波谱图和平均取代度可知，本次合成产物为PE-β-CD。由于2，3，6位上的羟基反应活性不同，缩合上的氧化乙烯基的数量不同，因此产物是混合物。
β-CD的溶血原因，据认为是由于可溶解细胞膜成分而使红细胞膜凹陷，高浓度时导致膜破裂造成重要组分如胆甾醇、磷脂及蛋白质的溶出或转移，与细胞类型无关。对膜的溶解力越大者溶血作用越强，与其水溶性和表面活性无关[1,6]。PE-β-CD对红细胞的溶血作用低的原因可能是因为它对脂质的溶解性较小有关，低浓度时引起红细胞皱缩，高浓度时才导致溶血[1]。
由于β-CD溶解度很小，其增溶能力受其溶解度的限制，因而增溶能力较小：而PE-β-CD的溶解度极大，随着PE-β-CD浓度的增加槲皮素的溶解度线性地增加，当PE-β-CD的浓度达到35mmol/L时，槲皮素的溶解度已达到4．92mmol/L。由此可以推断，PE-β-CD是一极具应用潜力的难溶性药物的增溶剂。
[参考文献]
[1]  黎洪珊，王培玉，β-环糊精衍生物的研究进展及在药剂学上的应用[J]．中国药学杂志，1999，34(4)：220-223．
[2]  郝爱友，张立新，张海光．化学滴定法测定羟乙基β-环糊精的平均取代度[J]．应用化学，2002，19(3)：301-303．
[3]  宋全道，丁易，米广太，等．部分甲基化-β-环糊精的合成、毒性及增溶作用[J]．中国医药工业杂志，1999，30(11)：494-496．
[4]  Rajewski，R A，Traiger G,Bresnahan J，et al．Prelimi-nary safety evaluation of administered sulfoalkyl ether-β-cyciodextrin derivatives[J]．Journal of Pharmaceutical Sciences,1995，84(8)：927-932．
[5]  Reer O，Bock T K，Muller B W．In vitro corneal perme-ability of diclofenac sodium in formulations containing cyclodextrins compared to the commercial product voltaren ophtha [J]．Journal of Pharmaceutic Sciences,1994，83(9)：1 345-1 349．
[6]  宋全道，丁易，米广太．羟乙基-β-环糊精的合成、溶血作用及增溶作用的研究[J]．山东大学学报(医学版)，2003，41(5)：488-490．
[7] 童林荟。环糊精化学-基础与应用[M]．北京：科学出版社，2001．38-48．