为了提取小球藻病毒基因组DNA，探索利用3％～10％的PEG8000加3％～7％的NaCl沉淀病毒。其中以7％的PEG和4％的NaCl沉淀效果最好，但其沉淀效率较低。
关键词：小球藻病毒，聚乙二醇8000．纯化
小球藻病毒为真核藻类病毒，属Phycodnaviridae科，Phycodnavirus属，模式株为PBCV-1。它既有真核生物病毒的性质，同时又具有某些原核生物病毒的性质，所以从一定意义上说它是一类介于真核生物病毒与噬菌体之间的病毒，因而分类地位十分特殊。深入研究真核藻类病毒的性质，将有可能使人们对生物的进化有进一步的认识，同时．由于已知真核藻类病毒具有相当大的基因组，可预见其基因产物的数目和功能具有多样性，目前已对少数基因进行了克隆、基因表达及表达产物功能分析，如甲基化酶基因M，CviBIII、M．CviRI、M．CviJI、M．CviBI，病毒外壳蛋白基因Pvp54[1]等。
深入研究小球藻病毒的分子生物学性质，首先要得到病毒基因组DNA。因此有必要探索大量提纯病毒的快速简便途径。一般分离提纯小球藻病毒都是采用超速离心的方法[2]，由于非常烦琐，只适合病毒的少量分离提纯。1963年Hebert就报遭可以用PEG沉淀植物病毒[3]，而后PEG法逐渐成为纯化植物病毒的重要手段[4]。因而用适当浓度的PEG纯化小球藻病毒是可能的。
1  材料和方法
1．1  材料
1．1．1  小球藻及小球藻病毒：小球藻NC64A株系由Van Etten和夏远南博土(Univet-sity of Nebraska)惠赠。小球藻病毒FJ-1由本室张远征博士分离自中国福建省。1．1．2  培养基：MBBM培养基是在Bold’s basal medium[5]中加入0．5％蔗糖和0．1％Bacto-peptone。MBBM软琼脂：在MBBM培养基中加入0．7％琼脂。MBBM琼脂：在MBBM培养基中加入1.4％琼脂。
1．1．3  仪器：  超速离心机为BECMEN80，高速离心机为HITACHI CR22E。
1．2  方法
1．2．1  小球藻NC64A株系的培养：接种NC64A细胞于MBBM培养基中，于25℃，连续光照、振荡(120r／min)培养至细胞浓度为1～2×107个／mL，备用。
表1  不同浓度PEG8000和NaCl的沉淀效果

注：为高速离心后粗提病毒的滴度
1．2．2  小球藻病毒FJ-1的纯化：取单个病毒空斑接种于2mL寄主细胞，连续光照摇动培养48h，扩大到150mL三角瓶中，培养72h。在4℃，5，000r／min离心5min，取上清，加10％NP-40至终浓度  1％，  再加入不同浓度的PEG8000和NaCl(见表1)，每个浓度两
个重复，于4℃过夜。经4℃，10，000r／min离心30min，弃上清，得粗病毒颗粒。用50mmol／L Tris-HCl，pH7．8重悬沉淀，于4℃，34，000r／min，离心30min，弃上清；50mmol／L Tris-HCl，pH7．8，重悬沉淀，再经10％～40％(W／V)蔗糖密度梯度离心(24．000r／min，4℃，40min)，吸取病毒带(位于离心管1／2～1／3处的一条带淡蓝色荧光的乳白色条带)，50mmol／L Tris-HCl pH7．8稀释。最后以34，000r／min，4℃，3h，沉淀病毒颗粒。
1．2．3  病毒空斑的检测：小球藻病毒FJ-1的空斑检测通过Van Etten[5]和张远征等[6]的方法进行。
1．2．4  病毒形态的电镜观察：参照田波等的方法[4]，纯化病毒颗粒用1％醋酸双氧铀负
染色，用日立H-500电子显微镜观察。
1．2．5  纯化病毒的收率：在纯化操作中的每一步骤，取样，测定其滴度，并计算其收率。
收率(％)=纯化操作后样品中总的病毒含量(PFU)／原始病毒裂解液中总的病毒含量(PFU)／100
2  结果和讨论
在一定的离子强度下，PEG可以使病毒沉淀，颗粒较小的圆形病毒需要较高浓度的PEG[7]。PEG的沉淀效果取决于病毒的特性、病毒浓度和溶液中盐的浓度。表1的结果证实了这一点。在NaCl一定的情况下，随着PEG浓度的升高，病毒沉淀的效果也越好。实验中发现，随着PEG浓度的增高非病毒物质的沉淀也增加，但这些非病毒物质的沉淀可在随后的洗涤过程中予以除去。沉淀的效率还与盐的浓度有关。实验表明在PEG8000为7％、NaCl为4％时，对小球藻病毒FJ-1的沉淀效果最好。表2的数据表明，虽然PEG8000可以有效的沉淀小球藻病毒，但其沉淀的效率较低，仅为21％，而采用超迷离心的方法沉淀小球藻病毒效率较高，可以达到36％。但在一般要求下，经高速离心后粗提的病毒完全可以满足提取其基因组DNA的要求，此时PEG沉淀病毒的收率为70％，因此，利用PEG8000沉淀小球藻病毒以期提取其基因组DNA，仍可认为是一种较

为简捷的方法。
目前，从国内外分离到的小球藻病毒均为球形多角体结构，直径125～200nm[8]。其中FJ-1直径较小，为120nm[1]。电镜观察表明，用PEG方法分离提纯的病毒颗粒与用一般超迷离心方法分离提纯的病毒颗粒在形态上没有明显的区别。
表2  两种方法沉淀瘤毒的收率

注：A，PEG8000沉淀的方法；B，超速离心的方法。
参  考  文  献
[1]  张远怔，樊卫国，李冬铃，等．微生物学报，1998．30(3)：176～180.
[2]  Narva KE，W wpdel D L，Skrdia M P，et al．Nucleic Acids Res，1987，15：9807～9823．
[3]  Hebert T T．Phytopathology，1963．53：362．
[4]  田  波，裴美云 植物病毒研究方法．北京：科学出版社，1987 165,178～183,194～207
[5]  Van Etten J L，Burbank D E，Kuczmarski D,et al.Science，1982,219：994～996．
[6]  张远征，王苏燕．盛  刚，等．微生物学报，1996，36(1)：67～68．
[7]  Yamamoto Virology,1970，40：734～744．
[8]  Van Etten J L，Lane L C，Meints R H．Murobiol Rew，1991，55：586～620．
PERCIPITATION OF CHLORELLA VIRUS FJ-1 BY
POLYETHYLENE GLYCOL(PEG8000)*
Han Jigang1,2 Kang Ming1，2  Liu Pingfang1  Wang Anli2 Yie Yin1 Tien Po1
(1Institute of Microbiology，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100080)
(2Callege of Life Science, Hebet University,Baoding 071002)
Abstract：Chlorella virus FJ-1 was isolated Fujian Province of China．It can be percipitated by polyethylene glycol(PEG8000)and the best condition if 7％ PEG8000 and 4％NaCl，But the per-cipitation efficiency PEG8000 is lower than that of ultracentrifugation.
Key words：Chlorella virus,PEG8000，Purification